對大部分實(shí)驗(yàn)人員來說，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實(shí)上，現(xiàn)有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會(huì)碰到問題呢？
組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。
關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解。現(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹/底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問題也就可以徹/底解決了。液氮碾磨就是最/有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個(gè)問題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 100% 能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法響應(yīng)也不同。總之，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動(dòng)物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) – 用嘴碾磨，腸胃抽提。
究竟怎樣才能確保 RNA 抽提的成功率呢？實(shí)驗(yàn)前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步；好的方法/試劑在確保成功的同時(shí)，操作方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。當(dāng)然，您的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因，以便改進(jìn)。
實(shí)驗(yàn)前方法/試劑的選擇
0：抽提 RNA 的目的
RNA 用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財(cái)。
1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素
樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹/底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹/底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。
2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素
樣品的破碎是為了徹/底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹/底完整地釋放出來。細(xì)胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。最/可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最/可/靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。
3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素
常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯/酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。
4：純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留。抽提速度的因素
對于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長。
問題解答 (外源性污染導(dǎo)致的問題不在本解答考慮中。防止外源性污染的辦法見 ‘Rnase 污染的10/大來源’)
RNA 的降解
理論上 28S:18S = 2.7:1，實(shí)踐中達(dá)到該比值幾乎沒有可能，并且沒有必要。降解的標(biāo)志是：28S:18S < 1。下面是最常見的導(dǎo)致 RNA 降解的原因及正確的做法：
新鮮細(xì)胞：如果試劑沒有問題，外源性污染也可以排除的話，降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞的話，一定要使裂解液能蓋住細(xì)胞。
新鮮組織：某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如肝臟，胸腺等)，即使使用電動(dòng)勻漿器勻漿也不能避免 RNA 的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。這些樣品使用玻璃勻漿器勻漿更不可靠。
冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至 – 70C 冰箱保存。樣品要相對小一點(diǎn)。樣品決不能不經(jīng)液氮速凍而直接保存于 –70C 冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細(xì)胞，如果不在液氮條件下碾磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA 比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以碾磨用具必須預(yù)冷，在碾磨過程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮。樣品碾碎后，在液氮?jiǎng)倓倱]發(fā)完時(shí)，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
A260 /A280 比值低
蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)項(xiàng)。減少起始樣品量，確保裂解完/全、徹/底。加入氯/仿后首先要使勁混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法是用 PCI 重新抽提一次，再沉淀，溶解。
苯/酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)項(xiàng)。加入氯/仿后首先要使勁混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法是再沉淀一次后，溶解。
設(shè)備限制：測定 A260 及 A280 數(shù)值時(shí)，要使 A260 讀數(shù)在 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。
用水稀釋樣品：測 OD 時(shí)，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。
A260 /A230 比值低
抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹/底懸浮 RNA，并且徹/底去掉 75% 乙醇。解決辦法是再沉淀一次后，溶解。
組織內(nèi)雜質(zhì)殘留：一般為多糖類雜質(zhì)。解決辦法是改用其它辦法，如 LiCl 沉淀。
設(shè)備限制：測定 A260 及 A280 數(shù)值時(shí)，要使 A260 讀數(shù)在 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。
奇怪的電泳帶型
非變性電泳：上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液時(shí)間太長，均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開。使用 2ug 上樣量，電壓小于 6V/cm，使用新鮮的電泳緩沖液并且頻繁混勻兩極的緩沖液，是獲得好的電泳結(jié)果的前提。(以 DNA 標(biāo)準(zhǔn)為參照，28S 和 18S 分別位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。)
變性電泳條帶變淡：EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些。另外的可能是甲醛的質(zhì)量不高。
下游實(shí)驗(yàn)效果不佳
RNA 降解：見上面。
抽提試劑的殘留：加入氯/仿后首先要使勁混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。75% 乙醇洗滌時(shí)，一定要使核酸沉淀懸浮起來。更好的是使用兩次洗滌，并且在倒掉第二次洗滌液后，再將離心管放入離心機(jī)中，離心數(shù)秒后，用移液器將殘留的乙醇小心吸掉。
樣品中雜質(zhì)的殘留：從富含多糖等雜質(zhì)的樣品中抽提 RNA 時(shí)，多糖往往同核酸一起被沉淀下來。用水溶解核酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)有一些粉末狀不溶物，往往就是多糖。高速離心后，將上清移入另外一個(gè)離心管中，再次沉淀核酸，可以減少這些雜質(zhì)。更好的是使用有針對性的純化方法。
DNA 污染：在 RNA 抽提操作中，少量 DNA 的污染是正常的，且對大部分下游實(shí)驗(yàn)沒有大的影響。降低樣品起始量或者增加溶液使用量，能將 DNA 的污染降低到電泳看不見的水平。能夠徹/底去除污染 DNA 的方法只有用 RNase-Free 的 DNase I 消化抽提的 RNA。殘留的 DNA 是否影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以用下面的實(shí)驗(yàn)檢測：以抽提好的 RNA 做模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：如果不出現(xiàn)目的條帶，DNA 的殘留無須去除，否則要使用 Dnase I 消化，或者重新試劑引物。
