在細(xì)胞和基因的微觀世界中研究探索，遺傳報(bào)告基因是非常有用的"可視化和量化"工具，具有廣泛的應(yīng)用。熒光素酶（螢光素酶）以出色的靈敏度、使用方便、可以定量檢測(cè)而成為理想的報(bào)告基因。

熒光素酶不是特定的分子，是一類中能催化產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，不同來源的熒光素酶各有特點(diǎn)，可催化底物發(fā)出不同顏色的光，有的還可以配合進(jìn)行雙色發(fā)光檢測(cè)。這種酶最早的來源，也是最有代表性一種來自學(xué)名為Photinus pyrali'的北美螢火蟲體內(nèi)的螢光素酶，之所以稱為螢光素酶，一方面也有助于區(qū)分需要激發(fā)光源才可以生成激發(fā)熒光的熒光蛋白，而螢光素酶是一個(gè)催化底物分解的發(fā)光反應(yīng)，熒光素酶在細(xì)胞內(nèi)沒有背景，因此可以檢測(cè)非常微弱的表達(dá)，靈敏度更高。不過，隨著發(fā)光檢測(cè)設(shè)備的不斷推進(jìn)和升級(jí)，生物發(fā)光靈敏度高，檢測(cè)方便的優(yōu)勢(shì)使得這類酶與熒光蛋白一起漸有取代其他報(bào)告基因的趨勢(shì)。于是，越來越多新的并非來自螢火蟲的新熒光素酶進(jìn)入市場(chǎng)，不再是“螢光"的天下了。  

種類更多 
來自螢火蟲的熒光素酶是最/經(jīng)典的熒光素酶，這個(gè)61KD單體酶無需修飾直接具有酶活，催化反應(yīng)依賴ATP，很適合作為遺傳報(bào)告基因，也最為人熟知；此外還有Renilla（海腎）熒光素酶，只有36KD大小的蛋白，底物是腔腸素，只需要氧氣，不需要ATP，發(fā)藍(lán)色光，一直是螢火蟲熒光素酶的替代，并常與螢火蟲熒光素酶組合成為雙色檢測(cè)，或者作為內(nèi)對(duì)照。

那么，讓我們來看看現(xiàn)在有哪些新熒光素酶了？
1. Gaussia熒光素酶，這是一種分泌型的藍(lán)色熒光素酶，蛋白分子量更小，只有22KD，含有天然的分泌型信號(hào)肽，可以引導(dǎo)熒光素酶分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，從而無需裂解細(xì)胞即可檢測(cè)報(bào)告基因活性。所表達(dá)的熒光素酶85%以上都會(huì)分泌至胞外，不過由于這種分泌型熒光素酶產(chǎn)生的信號(hào)比來自Firefly（螢火蟲）或Renilla（海腎）的信號(hào)強(qiáng)很多倍，所以還可以在細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)殘留的熒光素酶。分泌表達(dá)為檢測(cè)帶來很大的方便——不需要裂解珍貴的細(xì)胞，即可作活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)分析，連續(xù)時(shí)間曲線研究。可與紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測(cè)系統(tǒng)。

2. Cypridina（海螢）熒光素酶也是一種分泌型熒光素酶，呈美麗的藍(lán)紫色，蛋白分子量大小有62KD。同Gaussia一樣，大部分熒光素酶產(chǎn)物會(huì)分泌到胞外，可對(duì)活細(xì)胞實(shí)施連續(xù)檢測(cè)，非常方便。由于信號(hào)很強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)殘留的熒光素酶還足以進(jìn)行常規(guī)的裂解細(xì)胞檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。Cypridina（海螢）熒光素酶可與紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測(cè)。

3. Red Firefly（紅色螢火蟲）熒光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，與天然Firefly（螢火蟲）熒光素酶(綠色)相比，其發(fā)射峰遷移至紅光光譜區(qū)。這對(duì)于一直以來都是“綠肥紅瘦"的熒光素酶真是好消息。正是由于Red Firefly（紅色螢火蟲）熒光素酶的這種光譜遷移，使其能夠與Gaussia、Cypridina（海螢）或Green Renilla（綠色海腎）熒光素酶很好地區(qū)分開，從而可以組合使用。

4. 可共用同一底物的紅、綠兩色的叩頭蟲螢光素酶，大小一致，底物一致，相差只有幾個(gè)氨基酸，是雙色檢測(cè)的好選擇。

5. Green Renilla（綠色海腎）熒光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，與天然的Renilla（海腎）熒光素酶相比，在血清中穩(wěn)定性更高，發(fā)光強(qiáng)度更好。因此，使用綠色海腎（Green Renilla）熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)靈敏度更高。

同樣作為理想報(bào)告基因的熒光蛋白如GFP如今早也已經(jīng)是繽紛的七彩世界了，那么熒光蛋白和熒光素酶各自的特點(diǎn)在哪里呢？熒光蛋白并不是自身發(fā)光，而是需要一個(gè)激發(fā)光源才可以生成發(fā)射熒光，其發(fā)光能量來自于激發(fā)光。熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)不需要底物，無創(chuàng)，也不需要干擾細(xì)胞即可進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)；但激發(fā)光會(huì)引起背景熒光干擾（細(xì)胞、容器等在激發(fā)光源下也會(huì)產(chǎn)生一定的熒光），通常用于定性，或者半定量。
而熒光素酶發(fā)光是一個(gè)酶促反應(yīng)，需要加入底物后才有發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生。分泌型的熒光素酶需要取出上清進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)的熒光素酶來說還需要裂解細(xì)胞才能檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)在于熒光素酶在細(xì)胞內(nèi)沒有背景，因此可以檢測(cè)非常微弱的表達(dá)，具有超高的檢測(cè)靈敏度及寬廣的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍，可以精確定量。

檢測(cè)試劑靈敏度更高
如今的熒光素酶來源各不相同，各有所長，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑自然也越來越多花樣和講究。在過去只有螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的時(shí)代，因?yàn)檫@兩者都是胞內(nèi)表達(dá)，要檢測(cè)需要先裂解細(xì)胞，而且螢火蟲螢光素酶催化底物發(fā)光的持續(xù)時(shí)間比較短，對(duì)于批量處理來說需要配備自動(dòng)進(jìn)樣裝置的檢測(cè)設(shè)備，委實(shí)有點(diǎn)兒麻煩。如今有了分泌型表達(dá)的熒光素酶，就可以直接取上清進(jìn)行檢測(cè)，無需裂解細(xì)胞，可作活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)分析，進(jìn)行連續(xù)時(shí)間曲線研究，這就方便多了。分泌型熒光素酶進(jìn)入液相后會(huì)不會(huì)因?yàn)橄♂尪蟠蠼档托盘?hào)強(qiáng)度？這看來不用擔(dān)心，兩大類分泌型的熒光素酶催化底物的發(fā)光信號(hào)比原來的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶要高出2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，自然更靈敏，更適合微孔板檢測(cè)。
不僅如此，如今熒光素酶檢測(cè)試劑可根據(jù)所產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長短而細(xì)分為閃光型和輝光型。閃光型和輝光型發(fā)光信號(hào)的主要區(qū)別是它們的動(dòng)力學(xué)行為不同。加入底物后，閃光型發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生瞬時(shí)的發(fā)光信號(hào)，而輝光型發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)，有的可持續(xù)數(shù)小時(shí)。不難想象，通常閃光型發(fā)光強(qiáng)度會(huì)更大，檢測(cè)靈敏度比同類的輝光型酶發(fā)光強(qiáng)度更高。但輝光型檢測(cè)試劑因?yàn)榘l(fā)光持續(xù)時(shí)間長，無需使用自動(dòng)進(jìn)樣器，批處理起來也容易些。在選擇檢測(cè)試劑時(shí)需要特別注意。

單螢光素酶檢測(cè)的選擇相當(dāng)豐富，研究人員可以根據(jù)研究的需要自由組合不同的熒光素酶進(jìn)行多重檢測(cè)。

神奇的雙報(bào)告檢測(cè)新方法

說到多重檢測(cè)，值得注意的是，在用熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí)，通常會(huì)采用第二個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照，使第一個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化，從而減少實(shí)驗(yàn)的變化因素干擾，比如, 培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別, 細(xì)胞毒性，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等。

雙熒光素酶檢測(cè)可用于以下研究方向：
同時(shí)分析多個(gè)調(diào)控元件
同時(shí)分析多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
單次篩選一個(gè)以上的靶點(diǎn)，包括脫靶效應(yīng)
分析兩個(gè)或多個(gè)通路之間的相互作用
雖然在過去，也有采用熒光素酶結(jié)合氯霉/素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)組合作為雙報(bào)告基因體系，但熒光素酶定量檢測(cè)可在幾秒鐘內(nèi)完成, 而CAT, β-Gal和GUS則需要長時(shí)間的預(yù)處理；許多類型的細(xì)胞有內(nèi)源β-Gal或GUS表達(dá), 不利于準(zhǔn)確定量報(bào)告基因的表達(dá), 采用高溫下預(yù)處理細(xì)胞裂解液可降低內(nèi)源性β-Gal和CAT的干擾，但這些處理也會(huì)快速失活熒光素酶。因此,在此類雙報(bào)告基因檢測(cè)中, 必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液，相當(dāng)麻煩。

雙螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)，結(jié)合了螢火蟲熒光素酶檢測(cè)和海洋腔腸熒光素酶檢測(cè)，可在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),快速,靈敏,簡便。但是早期的雙螢光素酶技術(shù)需要先裂解細(xì)胞，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶，然后淬滅螢火蟲螢光同時(shí)激活海腎螢光素酶，再做第二個(gè)檢測(cè)，看起來有點(diǎn)麻煩，如今提供了Dual-Glo改進(jìn)成為加樣-檢測(cè)的均質(zhì)試劑。
不過最/方便的還是雙分泌型檢測(cè)：這是一種兩步法的檢測(cè)，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Gaussia分泌型熒光素酶和Cypridina（海螢）分泌型熒光素酶。這個(gè)雙報(bào)告系統(tǒng)可對(duì)來自同一細(xì)胞培養(yǎng)上清的熒光素酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定，靈敏度高，不僅節(jié)省了樣品處理時(shí)間，還降低了檢測(cè)的差異性。這兩種發(fā)光波長接近，不能用濾光片區(qū)分，需要將上清分為兩組分別用兩種底物檢測(cè)兩種酶活性。由于兩種熒光素酶的底物*不同，所以可以有效區(qū)分兩種酶的活性。

除了雙分泌型檢測(cè)，還有3組雙報(bào)告基因檢測(cè)（檢測(cè)胞內(nèi)熒光素酶）：
Gaussia –Red Firefly熒光素酶
Cypridina –Red Firefly熒光素酶
Green Renilla –Red Firefly熒光素酶

這是以光譜范圍來分辨兩種不同熒光素酶所產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)的方法，只需一步操作可實(shí)現(xiàn)雙重檢測(cè)。只用添加一種試劑（包含兩種底物），即可通過轉(zhuǎn)換濾光片對(duì)兩種發(fā)光信號(hào)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。這樣就可以省去了淬滅步驟和分步檢測(cè)的麻煩，在同一個(gè)樣品中同時(shí)對(duì)不同熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)定，操作簡單，結(jié)果同步性更好。其中的關(guān)鍵在于，每個(gè)組合中的兩個(gè)報(bào)告基因的發(fā)射光譜波長相差足夠遠(yuǎn)，能讓儀器很好的區(qū)分開。這時(shí)可以看出Red Firefly熒光素酶的光譜紅移的重要意義了吧。值得一提的是兩種分泌型熒光素酶，前面介紹過，雖然大部分的表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，但細(xì)胞內(nèi)仍有足夠強(qiáng)的熒光素酶活性，可用閃光或輝光型檢測(cè)試劑來檢測(cè)。

在實(shí)用中，熒光素酶的優(yōu)勢(shì)在于*的靈敏度和寬廣的動(dòng)態(tài)范圍可方便的進(jìn)行定量分析。熒光素酶的靈敏度很大程度取決于產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度。比較下來，分泌型熒光素酶，Cypridina（海螢）和Gaussia熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度最高，其次是Renilla（海腎）熒光素酶，最后是Firefly（螢火蟲）熒光素酶。
其他應(yīng)用
熒光素酶可被用做單報(bào)告基因在特定生物實(shí)驗(yàn)中研究某一生物學(xué)事件。因不同熒光素酶的發(fā)光光譜特性和底物都是不一樣的，所以還可以將多個(gè)不同的熒光素酶組合使用，進(jìn)行多重檢測(cè)。

多重檢測(cè)更適用于以下方面：
同時(shí)研究多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控
降低脫靶效應(yīng)
識(shí)別兩個(gè)或多個(gè)信號(hào)通路間的相互作用
將實(shí)驗(yàn)體系產(chǎn)生的“假象"歸一化

應(yīng)用
啟動(dòng)子研究中分析順式作用元件和反式作用因子
藥物篩選
siRNA和miRNA篩選
分泌途徑及蛋白定位報(bào)告基因檢測(cè)
活細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析
難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（包括干細(xì)胞和原代細(xì)胞）的研究
RNA 剪接研究