在過(guò)去十年里，多-能干細(xì)胞成為了多個(gè)領(lǐng)域的實(shí)用工具，幫助人們探索發(fā)育生物學(xué)、研究疾病病理和開(kāi)發(fā)細(xì)胞療法。

不論你用干細(xì)胞做什么研究，都離不開(kāi)低溫保存。冷凍可以保存珍貴的干細(xì)胞資源，不過(guò)冷凍干細(xì)胞可不像冷凍已分化細(xì)胞那么簡(jiǎn)單。我們不能簡(jiǎn)單沿用普通細(xì)胞的冷凍試劑和方案。

科學(xué)家們一開(kāi)始對(duì)人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行操作時(shí)發(fā)現(xiàn)，一次凍融循環(huán)之后只有5%的細(xì)胞還具有多-能性。這是因?yàn)閴毫l件會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生分化，如果保存的干細(xì)胞發(fā)生了隨機(jī)分化，就沒(méi)有價(jià)值了。

另外，冷凍還會(huì)激活一個(gè)程序性死亡通路，而且在絕大多數(shù)情況下添加凋亡抑制劑收效甚微。科學(xué)家們一直在試圖理解，低溫究竟對(duì)多-能干細(xì)胞產(chǎn)生了什么影響，希望在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)更好的冷凍方法，讓更多細(xì)胞存活下來(lái)。

應(yīng)該用什么來(lái)冷凍干細(xì)胞？

這個(gè)問(wèn)題的答案取決于你的細(xì)胞系，不過(guò)大多數(shù)成功的冷凍方案也有一些共同點(diǎn)。人們一般先用蛋白酶來(lái)解離細(xì)胞，然后進(jìn)行離心，最-后用含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基重懸。經(jīng)典的冷凍保存培養(yǎng)基，由90%的胎牛血清（FBS）和10%的DMSO組成，DMSO可幫助細(xì)胞抵御冷凍帶來(lái)的有害影響。但是如果你的細(xì)胞要用于人體，上述試劑就不合適了，它們可能有毒會(huì)帶來(lái)副作用。此外，使用90 FBS/10 DMSO混合物時(shí)，細(xì)胞復(fù)蘇之后的活性往往較差。近來(lái)，研究者們紛紛開(kāi)始使用無(wú)動(dòng)物源成份的試劑，以及更低濃度的DMSO。Caspase抑制劑常被用來(lái)避免細(xì)胞凋亡。

今年早些時(shí)候，RIKEN發(fā)育生物學(xué)中心的Teruo Akuta等人比較了不同的低溫保存方案和試劑，為自己的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多-能干細(xì)胞確定理想的培養(yǎng)基。他們發(fā)現(xiàn)，在冷凍前用鏈霉蛋白酶和螯和劑EDTA處理，可以提高干細(xì)胞的復(fù)蘇率。Akuta指出，干細(xì)胞喜歡抱團(tuán)生長(zhǎng)，但冷凍保護(hù)劑難以浸透較大的細(xì)胞團(tuán)塊，用鏈霉蛋白酶和螯和劑EDTA可以將細(xì)胞分成大小均一的小簇。Akuta團(tuán)隊(duì)還改良了商業(yè)化的低溫保護(hù)劑CP-1，CP-1含有羥yi基淀粉（植物源的冷凍保護(hù)劑）和DMSO。他們通過(guò)添加人血清白蛋白和乙二醇，進(jìn)一步提高了培養(yǎng)基的效力。研究顯示，添加乙二醇時(shí)的復(fù)蘇效lv最高，有活力的細(xì)胞占到44%。不過(guò)，這樣的組合并不一定適用于任何人。

“并沒(méi)有所謂的最jia冷凍保護(hù)劑，"牛津大學(xué)的Zhanfeng Cui說(shuō)。他建議新手們嘗試不同試劑，查閱用到了相同細(xì)胞系的文獻(xiàn)。許多人直接把細(xì)胞放在10% 的DMSO里冷凍，然后等著出現(xiàn)好結(jié)果。“花幾個(gè)小時(shí)查文獻(xiàn)，就能為你節(jié)省大量的時(shí)間，"他指出。“培養(yǎng)干細(xì)胞是個(gè)高成本又費(fèi)時(shí)的過(guò)程，我們要盡可能的保護(hù)資源。"

冷凍的速度重要么？

絕大多數(shù)低溫保存方案是，先將樣本放在–80 °C冰箱過(guò)夜，第二天再轉(zhuǎn)移到液氮進(jìn)行長(zhǎng)-期儲(chǔ)存。有研究發(fā)現(xiàn)，使用程序性的冷凍方法能獲得更好的結(jié)果。這種方法通過(guò)特殊設(shè)備，控制樣本溫度以穩(wěn)定速度降低（每分鐘幾度）。不過(guò)就算你沒(méi)有這樣的設(shè)備也不必灰心，因?yàn)橐灿形恼抡J(rèn)為最終的細(xì)胞產(chǎn)量并沒(méi)有太大差異。

現(xiàn)在還出現(xiàn)了一種新興的冷凍方法，即玻璃化（vitrification）。玻璃化是指通過(guò)超快速冷卻，形成糖漿一般的液態(tài)而不是結(jié)晶的固態(tài)。這種方法能避免形成冰晶，但需要高濃度的冷凍保護(hù)劑和特殊的設(shè)備。

還是那句話，要反復(fù)嘗試才能找到最shi合自己細(xì)胞的方案，"如果你只有–80度低溫冰箱，那么就試著優(yōu)化培養(yǎng)基提高產(chǎn)量。如果有條件，控制冷卻速度和玻璃化冷凍都很值得一試。

應(yīng)該如何復(fù)蘇干細(xì)胞？

在理論上，細(xì)胞在–196 °C的液氮中可以穩(wěn)定存在很多年。激活細(xì)胞死亡和分化通路的是冷凍和復(fù)蘇過(guò)程。因此，復(fù)蘇干細(xì)胞的時(shí)機(jī)完-全取決于你自身的需要。冷凍過(guò)程需要慢而穩(wěn)，而細(xì)胞復(fù)蘇要很快。

對(duì)于細(xì)胞復(fù)蘇而言，速度是很有必要的，現(xiàn)在大家都在追求快速?gòu)?fù)蘇。

干細(xì)胞的試管可以放在37°C水浴中解凍，然后用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸。如果想除去DMSO，還可以洗幾個(gè)循環(huán)。細(xì)胞復(fù)蘇之后，最-好用幾天時(shí)間來(lái)培養(yǎng)，篩查它們的功能是否正常。

我能得到怎樣的產(chǎn)量？

如果幸-運(yùn)的話（你的干細(xì)胞系特別有活力），第1次進(jìn)行凍融可能會(huì)得到40%、50%甚至更高的產(chǎn)量。但是如果你的產(chǎn)量只有10%左右甚至更低，也完-全用不著驚訝。方法的優(yōu)化往往需要多次嘗試。

另外計(jì)算產(chǎn)量不要操之過(guò)急，最初的細(xì)胞活力可能有誤導(dǎo)性，細(xì)胞解凍之后有時(shí)要過(guò)一會(huì)兒才開(kāi)始死亡，你可能會(huì)最終失去植板的細(xì)胞。研究顯示，細(xì)胞死亡在植板后大約24小時(shí)達(dá)到高峰，因此最-好等一等再來(lái)計(jì)算產(chǎn)量。

復(fù)蘇后的細(xì)胞還是干細(xì)胞么？

對(duì)于干細(xì)胞而言，復(fù)蘇得到活細(xì)胞并不是我們的最終目標(biāo)，關(guān)鍵問(wèn)題是，這些細(xì)胞是否喪失了多-能性。除了在顯微鏡下分析形態(tài)，觀察細(xì)胞植板后的生長(zhǎng)模式，他還建議在凍融循環(huán)前后用相應(yīng)標(biāo)記（例如Oct-4）進(jìn)行染色。這樣我們就能夠了解干細(xì)胞的分化情況。在細(xì)胞復(fù)蘇后，也可以通過(guò)商業(yè)化芯片來(lái)檢測(cè)拷貝數(shù)變異、表觀遺傳學(xué)改變和染色體畸變。

復(fù)蘇的產(chǎn)量低沒(méi)什么大問(wèn)題，我們只需要培養(yǎng)更多細(xì)胞就行。但是我們不能假定存活下來(lái)的細(xì)胞與原始細(xì)胞相同，特別是在產(chǎn)量很低的情況下。存活下來(lái)的細(xì)胞可能經(jīng)過(guò)了某種選擇。